NEUROLOGIE PRO PRAXI / Neurol. praxi. 2024;25(1)26-29 / www.neurologiepropraxi.cz 28 HLAVNÍ TÉMA Pokrok v intravitální laboratorní diagnostice prionových onemocnění: vysoce citlivá a specifická detekce prionů v mozkomíšním moku pomocí RT‑QuIC specificita RT‑QuIC je zajištěna nutností vysoké podobnosti aminokyselinové sekvence rekombinantního substrátu s priony přítomnými ve tkáních pacientů. Agregáty jiných amyloid tvořících proteinů (tau, alfa synuklein atd.) změnu tvaru rekombinantního prionového proteinu neindukují. Tyto vlastnosti umožňují detekci prionů v mozkomíšním moku a dalších tkáních pacientů za jejich života, krátce po objevení příznaků onemocnění. V případě využití mozkomíšního moku či stěru čichové sliznice se dosahuje často více než 95% senzitivity a téměř 100% specificity. Vznikající agregovaný rekombinantní protein navíc není infekční a tak se snižuje i riziko profesionální nákazy pracovníků v laboratoři. Výjimečné vlastnosti RT‑QuIC vedly k jeho nedávnému zařazení do nových WHO diagnostických kritérií pro sporadickou CJN (Jankovska, 2021). K diagnóze pravděpodobné CJN tak nově stačí přítomnost neuropsychiatrického onemocnění a pozitivní RT‑QuIC. Dostupnost prionového RT‑QuIC v České republice Vyšetření RT‑QuIC není v současné době dostupné komerčně, ale pouze v rámci probíhající výzkumné studie na našem pracovišti. Naše laboratoř ve spolupráci s Národní referenční laboratoří lidských prionových onemocnění a skupinou Jiřího Šafáře (Western Case Reserve University, Cleveland, Ohio) zavedla do praxe druhou generaci prionového RT‑QuIC testu. Pomocí archivních vzorků mozkomíšního moku a mozkové tkáně jsme ověřili schopnost zavedené metody detekovat všechny typy prionových onemocnění, které se vyskytují v České republice (Moško, 2021). V pilotní studii jsme navíc zjistili, že priony lze detekovat i v kůži většiny zemřelých CJN pacientů (Baranová, 2023). Aktuálně probíhá otevřená prospektivní studie, ve které ve spolupráci s klinickými neurologickými pracovišti ověřujeme diagnostickou spolehlivost metody RT‑QuIC u žijících pacientů s podezřením na prionové onemocnění. Studie je otevřena pro všechny neurologické kliniky. V případě podezření na prionové onemocnění je standardně indikována diagnostická lumbální punkce pro stanovení přítomnosti proteinu 14-3-3 eventuálně dalších markerů, jako je tau protein. Při zájmu o provedení RT‑QuIC vyšetření na priony je možné po získání informovaného souhlasu zaslat malý alikvot (0,5–1 ml) odebraného likvoru na naše pracoviště. Podrobnosti k transportu lze získat mailem od autora tohoto článku. Případně lze kontaktovat pracovníky NRL, kteří z alikvotu mozkomíšního moku určeného pro analýzu proteinu 14-3-3 zajistí dopravu vzorku do prionové laboratoře. Likvor nesmí mít příměs krve, proto není vhodné použít jeho první podíl, což je ale stejné pravidlo, které platí pro vyšetřování přítomnosti proteinu 14-3-3. Mozkomíšní mok se do transportu uchovává v lednici a transport probíhá za chladu. V případě nutnosti je možné mok zmrazit a uchovávat zmražený. Vzorky se vyšetřují v kvadruplikátu, a to jak neředěné, tak 10× ředěné, aby se eliminoval vliv případných inhibitorů RT‑QuIC reakce. Za pozitivní se považuje vzorek, který dá pozitivní reakci minimálně ve 2 jamkách ze 4. Z doposud vyšetřených 52 vzorků mozkomíšního moku bylo 16 RT‑QuIC pozitivních. Z těchto 16 pacientů již bylo 10 neuropatologicky verifikováno a ve všech případech byla přítomnost prionového onemocnění neuropatologicky potvrzena. Příklady záznamu pozitivního a negativního RT‑QuIC testu jsou na obrázku 3. Bohužel většina RT‑QuIC negativních případů nebyla následně nekropticky verifikována, tudíž v naší prospektivně vyšetřené kohortě nejsme schopni určit přesnou senzitivitu a specificitu s ohledem na potenciální falešně negativní případy. Určitě by bylo vhodné všechny případy vyšetřené RT‑QuIC následně neuropatologicky analyzovat. Výsledky prospektivní studie by měly posloužit jako podklad pro jednání se zdravotními pojišťovnami a ministerstvem pro získání úhrady vyšetření. RT‑QuIC – budoucnost laboratorní diagnostiky neurodegenerativních proteinopatií? Metoda RT‑QuIC představuje naději pro výrazné zrychlení pravděpodobné diagnózy prionového onemocnění, a tím otevírá možnost pro budoucí aplikaci v současnosti vyvíjených terapeutických postupů. Nicméně již nyní může včasná diagnóza prionového onemocnění omezit počet nadbytečných vyšetření a umožnit rychlé nasazení paliativní péče. To ve svém důsledku zvyšuje kvalitu života pacienta i jeho blízkých a vede k úspoře nákladů na zdravotní péči. Sledování přítomnosti prion konvertující aktivity u bezpříznaObr. 3. Záznam RT-QuIC vyšetření mozkomíšního moku pacientů na přítomnost prion konvertující aktivity Negativní výsledek (A), pozitivní výsledek (B). Vzorky jsou vyšetřovány v kvadruplikátu (sloupce). 1 – pozitivní kontrola (mozkový homogenát pacienta se sporadickou CJN, typ MM1), 2 – negativní kontrola (pufr), 3 – mok paci‑ enta (10× ředěný), 4 – mok pacienta (neředěný), 5 – negativní kontrola (pufr). Reakce probíhala po dobu 60 hodin za teploty 55 °C, střídání 60 s inkubace v klidu s 60 s intenzivního třepání (700 RPM). Pacient B) je pozitivní ve 3 ze 4 jamek u 10× ředěného likvoru a ve 4 ze 4 jamek u likvoru neředěného. Obr. 2. Princip vyšetření mozkomíšního moku pomocí RT-QuIC na přítomnost prionů Malé množství vzorku moku pacienta získaného lumbální punkcí se přidá k reakční směsi obsahující rekombi‑ nantní prionový protein (PrP) a fluorescenční indikátor Thioflavin T. Destička s napipetovanými vzorky se inkubuje ve fluorescenčním spektrofotometru za pravidelného střídání inkubační fáze a fáze intenzivního třepání. Ve vzor‑ ku přítomný patologický prionový protein (PrPSc) mění konformaci rekombinantního PrP a vznikající agregáty PrP váží Thioflavin T, který po navázání produkuje fluorescenci. Třepání rozlamuje vznikající agregáty za vzniku no‑ vých agregačních center a dochází tak k amplifikaci signálu. PrPSc Vzorek Rekombinantní PrP Thioflavin T inkubace, 55˚C, 60 s 700 RPM, 55 ˚C, 60 s fluorescenční spektrofotometr cyklická amplifikace 48–60 h prion negativní výsledek
RkJQdWJsaXNoZXIy NDA4Mjc=